Mangfoldigjøre DNA

Metoder for mangfoldiggjøring av DNA kan brukes for å teste for eksempel virus. Her er litt mer tekniske detaljer.

PCR-reaksjonen

PCR-metoden gjør det mulig å oppformere en bestemt bit av et gen i et reagensrør. Det har hatt enorm betydning for moderne genteknologi.

Etter en vellykket PCR får man rikelig med genbiter av nøyaktig samme lengde. Disse er det lett å påvise ved å sende elektrisk strøm gjennom en bit agar-gel, en varmestabil gelé. Alle genbitene fra PCR-reaksjonen havner på samme sted i gelbiten, siden de reagerer helt likt på strømmen.

Hvis utgangspunktet for PCR-reaksjonen er å påvise RNA, må RNA omgjøres til DNA før reaksjonen kan settes igang. Dette gjøres ved hjelp av et enzym som kalles revers transkriptase. (Det er det samme type enzym som HIV bruker for å integrere seg i DNA i cellene våre). Når PCR-reaksjonen baserer seg på dette ekstra trinnet, kalles metoden gjerne RT-PCR. SARS-CoV-2 er et RNA virus, så her må man bruke RT-PCR for å kunne påvise viruset ved hjelp av PCR.

Sykliske temperaturskift

Skjematisk framstilling av hvordan PCR mangfoldiggjøring av DNA. DNA er dobbelttrådet, og sekvensen på den ene tråden er komplementær og i motsatt orientering til den andre. Dette blir utnyttet i PCR. Orienteringen av DNA er markert ved 5′ merking.Mellom hver runde av PCR reaksjonen, 1, 2,4, …n, varmes prøven opp så de to DNA trådene går fra hverandre. Når temperaturen senkes, kan de kunstige DNA bitene som passer med 5′ ende av de to DNA trådene, feste seg og bli forlenget av et varmestabilt enzym som var tilsatt til prøven. Etter 35-40 runder har vi fått enormt mye DNA av akkurat denne lengden med akkurat denne sekvensen. Dette «PCR-produktet» er lett å påvise ved hjelp av separasjon av prøven i et elektrisk felt. Alle PCR-bitene er like lange, og påvirkes likt av det elektriske feltet.

PCR-reaksjonen er syklisk. I hver syklus endres temperaturen tre ganger, fra 95 via 55 til 72 grader. Temperaturskiftene er nødvendig for de ulike trinnene i prosessen. Før vi fikk PCR-maskiner med varmeblokker som kunne endre temperaturen raskt, var det noen av oss som tålmodig flyttet prøvene fra vannbad til vannbad for å få til de nødvendige temperaturendringene.

For hver syklus blir det dobbelt så mye PCR-produkt i prøven. Siden noen av kjemikaliene i prøven forbrukes underveis, vil det riktignok flate ut etter hvert. Etter 30-35 sykluser med vanlige mengder med kjemikalier og prøvemateriale har man typisk nådd toppen av hva som er mulig å oppnå i én enkelt PCR-reaksjon.

Siden mengden produkt dobler seg for hver syklus, er PCR-reaksjonen potensielt svært følsom, og kan brukes for å oppdage svært små mengder av ett bestemt gen (fra for eksempel et virus).

Telle virus

Det er mulig å bruke PCR-reaksjonen for å anslå hvor mange genbiter det var i prøven fra start. Det kalles kvantitativ PCR, eller qPCR.

Det gjøres ved at mengden PCR-produkt blir målt for hver syklus. I de første 10-15 syklusene vil mengde PCR-produkt være så lite at det ikke kan oppdages. Antall virus i prøven kan dermed anslås indirekte ved å angi hvor mange sykluser som var nødvendig for å kunne påvise PCR-produkt i prøven. Et lavt tall = mye virus. Et høyt tall = veldig lite eller ingen virus.

Løkkebasert mangfoldigjøring

Prinsipp for løkkebasert mangfoldiggøring. I en veldig enkel form består den av en sirkulær DNA tråd, som binder seg til mål-sekvensen, for eksempel SARS-CoV-2. Testen kan lages gjerne slik at løkken først må limes sammen etter å ha bundet seg til virus-RNA eller DNA. En ekstra kunstig DNA bit som passer med løkken som dannes, forlenges ved hjelp av et enzym. Tråden vil forlenges i det uendelige, fordi enzymet dytter den nylagete tråden vekk. Varianter av denne teknikken kalles LAMP, løkkebasert amplifisering.

Løkkebasert DNA mangfoldiggjøring kan gjøres uten temperaturskifter. Det er nok å tilsette de nødvendige kjemikaliene og deretter holde prøven på en bestemt temperatur over en viss tid.

Det forutsetter at enzymet som brukes for å lage mer DNA tråd, kan dytte foran seg den nylagete tråden, slik at det hele tiden er en enkelt-tråd å jobbe med. Denne metoden er i prinsippet så enkel, at det vil være mulig å lage hjemmebaserte tester, der folk kan teste seg selv, ved hjelp av et kit og noen instruksjoner om hvordan prøven skal behandles.

Det mangfoldiggjorte DNA kan lett påvises, enten ved å se at prøven blir blakket, eller at en fargereaksjon som er avhengig av det nylagete DNA blir sterkere og sterkere ettersom tiden går. Eventuelt ved å klippe opp det mangfoldigjorte DNA, og teste resultatet ved væsketransport i en papirstrips.

Løkkebasert mangfoldiggjøring kan gjøres kvantitativ, men egner seg nok best til et ja eller nei svar. Er prøven positiv eller ikke?

Bloggside av Anne Spurkland, publisert 11. april. 2020, sist oppdatert 17. April 2020